程：  傳真  

 河豚毒素（TTX）定量酶聯(lián)免疫檢測試劑盒說明

本測試盒用間接競爭免疫分析法定量測定河豚魚中的河豚毒素（TTX）。該測試盒反應(yīng)孔可拆卸，可測單份樣品，也可測多份樣品。定量分析時需有含450nm波長的微孔板酶標儀。

1 概要

河豚毒素（TTX）是一種強神經(jīng)毒素，其性質(zhì)穩(wěn)定，加熱、鹽腌及高溫烹煮均不易使其被破壞。河豚魚中常含有河豚毒素。我國沿海居民素有食用河豚魚的習慣。因誤食或食用加工不當?shù)暮与圄~而發(fā)生人畜中毒的事件每年都有發(fā)生。故準確檢測河豚魚中的河豚毒素對預(yù)防和控制河豚毒素中毒，具有重要意義。本檢測方法具有靈敏、快速、簡便、特異性好、取樣量小并可同時檢測大量樣品等優(yōu)點。

2 測定原理

本試劑盒采用固相酶聯(lián)免疫吸附原理，利用間接競爭ELISA法進行測定。用抗原包被微孔板，加入河豚毒素標準品或樣品、抗河豚毒素單克隆抗體進行孵育后，將未與包被抗原結(jié)合的抗體洗去；再加入酶標記的抗鼠IgG抗體孵育，加入顯色液，經(jīng)過終止液終止后，用酶標儀在450nm處測定OD值。

3 提供的物品

微孔板

5個濃度的TTX標準溶液（各0.5mL）

標準1：0ng/mL   ……………………………………………直接使用

標準2：10.0ng/mL      ………………………………………直接使用

標準3：20.0ng/mL      ………………………………………直接使用

標準4：50.0ng/mL      ………………………………………直接使用

標準5：200.0ng/mL    ………………………………………直接使用

抗體溶液（6mL）     ………………………………………………直接使用

酶標物（12mL）       ………………………………………………直接使用

顯色液（12mL）       ………………………………………………直接使用

終止液（6mL） ………………………………………………………直接使用

濃縮洗液（30mL）   …………………………………………………稀釋使用

4 盒中未提供，需自備物品

微孔板酶標儀（含450nm）、離心機、電爐、微量移液器、磁力攪拌器

量筒、漏斗、容量瓶、快速定性濾紙、分液漏斗

乙 酸、*、去離子水或蒸餾水、PBS緩沖液

5 操作者注意事項

        標準溶液中含有TTX毒素，應(yīng)特別小心。

終止液為0.5M硫 酸，避免接觸皮膚。

每次加樣后立即將所有試劑放回2~8 ℃。

每步加樣時間應(yīng)控制在5min內(nèi)。

孵育過程中應(yīng)避光。

不要使用過期試劑盒。

        不要交叉使用不同批號試劑盒中的試劑。

6 儲存條件

        保存試劑盒于2~8℃。不要冷凍

        顯色液對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

        將不用的微孔板放進原鋁箔袋中，置2~8℃保存。

7 試劑變質(zhì)的標志

        標準1的吸光度值小于0.5個單位（A_450nm<0.5）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8 樣品處理

8.1 鮮河豚魚中河豚毒素的檢測

----稱取5g河豚魚樣品（肌肉、皮或內(nèi)臟），剪碎，加入25mL 0.1%的乙 酸，用燒杯在電爐上煮沸攪拌10min。此步驟應(yīng)注意不要讓液體沸出容器，應(yīng)控制加熱溫度，并不斷攪拌。

----待冷卻至室溫后，上清用快速定性濾紙過濾于50mL離心管中

----沉淀用20mL0.1% 乙 酸洗到燒杯中，再煮沸3min

----冷卻至室溫后，所有的液體及煮沸的樣品都加到離心管中，3000rpm離心10min。

----取上清，量體積，置分液漏斗中

----加入等體積乙迷，振搖1分鐘，靜置分層。放出水層，量體積后至另一分液漏斗中，再加入等體積的乙迷，振搖1分鐘，靜止分層。

----將水層放入50mL容量瓶中，用1M*調(diào)節(jié)提取液中的pH值至6.5~7.4，然后加入PBS至50mL，提取液4℃保存?zhèn)溆谩?/span>

8.2 魚片、魚干制品中河豚毒素的檢測

-----樣品中的TTX用0.1%乙 酸在水浴中超聲提取，提取液中的TTX用ELISA方法進行檢測，若樣品中TTX含量低于檢出限則報告為<100mg/kg；樣品中TTX含量在100~3000mg/kg之間，直接按ELISA實驗結(jié)果報告；如果樣品中TTX含量達到3000mg/kg，則需采用小鼠生物測定法進行驗證，確認毒性反應(yīng)后再按照ELISA實驗結(jié)果報告。 

9 酶免疫分析程序

----濃縮洗液為10倍濃縮液，使用時與去離子水或蒸餾水按體積比1:9稀釋后使用。

----取所需數(shù)量的板條插入微孔架，用洗液洗滌微孔板3min×2次，記錄樣品及標準的位置。

        ----加入50mL標準品或處理好的樣品到微孔，每個標準和樣品必須使用新的吸頭。

----加入50mL抗河豚毒素單克隆抗體溶液到每個微孔（注意移液器管尖不要接觸到孔中的液體，避免交叉污染）中，37℃孵育90min。

----甩掉孔中液體，用洗液洗滌微孔板3min×3次，zui后一次應(yīng)在吸水紙上拍打以*除去孔中液體。

    ----每孔加入酶標物100mL，37℃孵育60min。

    ----用洗液洗滌微孔板3min×5次，zui后一次應(yīng)在吸水紙上拍打以*除去孔中液體。

    ----每孔加入顯色液100mL（2滴），37℃孵育12min。

----每孔加入終止液50mL（1滴），立即用酶標儀在波長450nm處測定吸光度值（OD值）。

注：在定量分析中，顯色液和終止液需要用移液器準確量取。

10 樣品濃度計算

以標準溶液OD值與標準1的OD值的比值為縱坐標（即標準品OD比），所對應(yīng)標準溶液濃度（ng/mL）的對數(shù)值為橫坐標，制作標準曲線。根據(jù)樣品OD值與標準1的OD的比值（即樣品OD比），可從曲線上得到對應(yīng)點的橫坐標，即為TTX濃度的對數(shù)值，求得反對數(shù)即為測定液中TTX濃度C（ng/mL），按下列公式計算出樣品中TTX含量：

TTX含量（mg/kg）= 10×C×K

式中：C：測定液中TTX濃度（ng/mL）

            K：提取液的稀釋倍數(shù)

11 主要技術(shù)指標及參數(shù)

11.1  zui低檢出濃度10.0 ng/mL。

11.2  加標回收率在70~120%，條內(nèi)變異系數(shù)＜10%，條件變異系數(shù)＜15%。

附圖（僅供參考）